乳糖酶项目

 

    乳糖酶能将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖,用于处理加工牛乳、乳清等生产低乳糖牛奶和低乳糖乳制品。用来治疗乳糖不耐受症。乳糖是牛乳中主要的糖成分,其含量约为5%左右。许多成人(因人种而异,亚洲、非洲占的比例较大)体内缺乏乳糖酶,因此他们很难消化牛奶,饮用牛奶后,乳糖到了肠道里,被肠道细菌分解发酵,产生大量二氧化碳气体,使肠道膨胀,收缩加强,造成肠鸣、腹胀、腹泻等,这种疾病称作乳糖不耐受症。由于乳糖不耐受症的普遍存在,使相当一部分人无法充分消化吸收牛乳这一天然、具有良好平衡型的食品中的营养成份,成为阻碍我国乳品工业发展的主要占障碍之一。低乳糖牛奶和低乳糖乳制品是解决这一  问题的最有效的方法,而生产低乳糖牛奶和低乳糖乳制品必需依赖一种高效的生物催化剂—乳糖酶。

    全球对于乳糖酶工业化生产的研究业已开展几十年,我国的研究历史也较长,但目前乳糖酶并未在食品工业中得到广泛应用,主要原因是:(1)乳糖酶的单位产量较低;(2)市场上销售的乳糖酶多为胞内酶,酶的耐热性差、适用范围窄;且这种酵母来源的胞内酶,需破碎细胞才能得到,提取、纯化工艺繁杂。由于上述原因致使乳糖酶销售价格过高、应用成本昂贵、适用范围窄,不能满足食品和乳制品工业多方面的需要。

    由中国工程院范云六院士指导的研究小组, 利用现代分子生物学和基因工程技术, 通过3年的攻关, 开发了一种新型高效的乳糖酶及其廉价生产技术。研究小组筛选到一种新型乳糖酶, 它在实际应用中的有效性、热稳定性、抗逆性和广谱性方面均优于国外目前商品化生产的乳糖酶, 进一步克隆到了此酶的新基因, 首次成功地构建了高效表达乳糖酶的重组生物反应器, 乳糖酶的单位表达量近6g/L,是目前国外商品化生产的基因工程曲霉的6倍; 同时, 表达的乳糖酶还可自行分泌到细胞外, 一举解决了目前乳糖酶生产过程中的单位产量低、酶后加工困难的问题, 使乳糖酶的工业化廉价生产成为可能。

    2002年8月21日 该项受到国家食物与营养咨询委员会主任卢良恕院士等多位专家高度评价的高新技术成 果—“利用生物技术开发一种新型乳糖酶及其高效生产途径”通过农业部的科学技术成果鉴定, 由中国科学院田波院士为主任和我国一流的分子生物学、微生物学、食品工业等领域的专家组成的鉴定委员会一致认为, 该项目为解决乳糖不耐受症提供了有效途径,可促进乳品消费量,对乳业发展以及推动“奶业振兴计划”、“学生奶计划”、“学生长高工程”的实施具有重要意义, 其技术水平达到国际领先水平, 具有我国独立自主的知识产权。

    另外,利用该技术生产乳糖酶还具有发酵方法简便易操作、发酵原料便宜易得、对设备要求低、发酵时间相对较短、乳糖酶产量大且稳定等特点, 国内发酵厂家中目前现有的设备即可满足乳糖酶低成本生产的需要, 大、中、小发酵企业均可生产。乳糖酶的生产也不产生任何有毒有害的污染物, 不会造成环境污染, 为环保型技术, 有很好的技术推广前景。

    该成果是我国在食品工业中应用基因工程等高新技术并取得重大突破的高科技含量的、有实际应用价值和广阔应用前景的高科技成果,其科学技术水平处于国际领先地位, 并具有独立自主的知识产权。它的产业化一方面能创造巨大的社会、生态和经济效益, 对改善人民的生活水平、提高人民的生活质量有重要意义, 另一方面, 它还将在推动基因工程等高新技术向传统食品工业渗入、开辟食品工业新领域等方面起示范作用。

 

新型乳糖酶的技术特性:

    1. 克隆并获得乳糖酶新基因,此基因在GenbanK中登录,登录号为:EMBL ACCESSION No. AJ431643。此新型乳糖酶在酶学性质上与一些商业化的乳糖酶相比具一定优越性。与商业化米曲霉乳糖酶相比,在热稳定性、金属离子稳定性、比活、Km值、pH范围等方面均有优越性;与商业化酵母乳糖酶相比,具pH适应范围宽、热稳定性强等优点。该乳糖酶具有更优越的酶学性质,能适用于不同的乳制品,生产不同类型的产品。

    2. 乳糖酶基因通过毕赤酵母表达系统获得高效生产,分泌表达量近6g/L,酶活为3600U/mL,是目前报道的工程米曲霉最高表达量的6倍,且发酵液中杂蛋白含量很少,乳糖酶占发酵液中总分泌蛋白的90%以上。由此解决了乳糖酶生产中单位产量低、胞内酶提取困难的问题。此新乳糖酶基因与发酵生产工艺已申请中国发明专利,申请号为:0210811.74。

    3. 在水解牛奶的应用实验中,新型乳糖酶在不同温度下(6℃、12℃、37℃、50℃、60℃)、不同时间内均有较好的乳糖水解效果,乳糖水解率可达80%~92%。

技术优势与生产经验:

    范云六院士领导的课题组长期从事分子生物学及高新生物技术的研究工作。特别在利用毕赤酵母作为生物反应器高效生产有实用价值的酶制剂方面积累了丰富的经验。早在1993年范院士就开始与其学生合作进行了大量的有关毕赤酵母重组生物反应器的分子生物学及应用研究,并取得较大突破。先后承担了“九五”期间有关利用毕赤酵母高效表达、生产饲料用酶的两项“863”研究项目及“863”中试开发项目,均取得了重大突破,通过了国家科学技术成果鉴定,其技术达到了国际领先水平。获得中国发明专利, 具有独立自主的知识产权。在不到4年的时间中,完成了从实验室研究到产业化生产的全过程, 获得国家计委重大产业化示范工程项目的资助(总投资额1亿元)并被列为“863”农业生物技术领域五项重大产业化项目之一, 2000年初实现了大规模产业化生产, 取得了较大的直接经济效益和环境、生态效益。

    通过以上这些工作,我们无论在毕赤酵母表达系统的分子生物学研究、外源基因的改造,还是在重组毕赤酵母高效表达生物反应器的构建、利用重组酵母大规模产业化生产目的产物的生产工艺上都建立了有效的方法体系,积累了较丰富的经验,这为本项目的实施奠定了基础。

    (1)通过分子元件的优化和改造、受体菌的突变和筛选,构建了我们特有的稳定、高效表达外源基因的毕赤酵母表达系统,其优势在于:1) 单位表达量更高,尤其对以往在原始毕赤酵母表达系统中表达量较低的外源基因可大副度提高其表达量。我们已在此系统中表达了近十个外源基因, 其表达量均在2mg/mL以上, 主持的“863”项目中的多种植酸酶基因达到了8~12mg/mL;2) 构建的重组酵母其表达的稳定性更好。如构建的高效表达酸性植酸酶的重组毕赤酵母,在5L发酵罐中连续发酵50批次、30吨和60吨发酵罐中积累生产了100余批次,其植酸酶表达积累曲线和表达量均无变化。

    (2)建立了对外源基因评估、改造的方法体系。如我们在毕赤酵母中已表达的酸性植酸酶基因和中性植酸酶基因,改造后的基因比未改造的在酵母中表达量分别提高37倍和30倍。创立了在生产水平上利用基因工程毕赤酵母生产目的蛋白的高细胞密度发酵新工艺,国外到目前为止还未有在生产水平上的重组毕赤酵母高细胞密度发酵工艺。

     因此,我们在乳糖酶的高效生产方面有较丰富的经验,不但在实验室水平的有成熟经验在30吨、60吨罐大规模生产中也积累了较成熟的经验。